Изабелла - дочь Хуана II, короля Кастилии, и второй жены его, инфанты португальской Изабеллы. После смерти отца в 1454 году, королем Кастилии стал старший брат Изабеллы — Энрике IV. Из-за своей неспособности произвести потомство этот правитель получил прозвище «Бессильный» (исп. El Impotente) — считается, что его первая жена Бланка Арагонская, принцесса Вианская, осталась девственницей после 13 лет брака, закончившегося разводом. Второй раз король женился на Жуане Португальской, сестре короля Альфонса V Африканца, которая также, как говорили, оставшись нетронутой после первой брачной ночи, вскоре взяла себе любовника Бельтрана де ла Куэва. Рождённая ею девочка, Хуана, воспринималась всеми как плод адюльтера и получила прозвище «Бельтранеха» в честь своего предполагаемого отца. Со второй женой король также развёлся. Эти факторы — бессильность короля Энрике, измены королевы Жуаны и сомнительность её дочери Хуаны сделали вопрос престолонаследия актуальным. Знать принудила короля Энрике назвать наследником своего младшего брата Альфонсо (XII) Соперника (Изабелла была средним ребёнком). Король первоначально согласился, предполагая, что Альфонсо женится на его дочери Хуане Бельтранехе, но спустя некоторое время передумал.

Кортесы, взяв под контроль Альфонсо и провозгласив его наследником, вступили в борьбу с королем Энрике (битва при Ольмедо, 1467 год). Вся Кастилия разделилась на два враждебных лагеря: северные провинции были за Энрике, южные — за Альфонса. Год спустя в возрасте 14 лет Альфонсо умер, и надежды мятежных дворян сосредоточились на Изабелле. Но она отвергла их заигрывания, оставаясь лояльной к брату, и он официально провозгласил её наследницей престола. Наконец в 1468 году у Быков Гисандо был подписан договор, в силу которого наследницей престола (принцессой Астурийской) признавалась Изабелла, причём король обязывался не принуждать её к нежелательному для неё браку, а она обязывалась не выходить замуж без согласия брата. Король уже официально пренебрёг своей предполагаемой дочерью Хуаной Бельтранехой, которую, в свою очередь, в 1457 году её дядя португальский король Альфонс V взял в жёны с целью закрепления своих притязаний на Кастилию. Но брак был аннулирован папой римским Сикстом IV из-за близкого родства. Энрике IV пытался выдать свою сестру Изабеллу замуж, предлагая ей несколько кандидатов, но она отвергала его вариант, избрав Фердинанда, принца Арагонского. Брак с Фердинандом был заключён 19 октября 1469 года, втайне, так как король Энрике не дал на него своего разрешения. Свита жениха прибыла в Кастилию, переодевшись купцами. Кроме того, так как жених и невеста были кузенами, требовалось разрешение от папы. Необходимый документ был сфабрикован, и разрешение было получено задним числом.

Фердинанд Фердинанд, наследник трона Арагона, в силу брачного договора обязывался жить в Кастилии, соблюдать законы страны и ничего не предпринимать без согласия Изабеллы, становясь, таким образом, принцем-консортом при будущей королеве. Энрике объявил сестру нарушившей договор и лишённой престола. Но сторонники Изабеллы поднялись в защиту её прав, и междоусобия возобновились; среди них Энрике умер, и кортесы, в 1475 году, признали Изабеллу королевой. Тем не менее, оба королевства продолжали сохранять автономию — их институты власти, а также другие социальные и экономические структуры были полностью раздельными, в Кастилии и Арагоне даже говорили на разных языках. В течение своего почти 30-летнего царствования, богатого событиями, Изабелла сумела возвысить королевскую власть Кастилии до небывалой дотоле высоты. Самоуправство кастильских грандов и независимость городов были сильно ограничены введением эрмандады; кортесы все более утрачивали свою самостоятельность и подчинялись королевскому абсолютизму. Ту же участь испытали и 3 духовно-рыцарских ордена Кастилии (сантиагский, калатравский и алькантарский), после того, как Изабелла сделала своего мужа их великим магистром. В религиозных делах Изабелла стремилась ограничить зависимость кастильской церкви от римской курии и ещё более подчинить её королевскому авторитету.

Будучи годом старше своего мужа, Изабелла отличалась красотой, умом, энергией, возвышенным и непреклонным характером, отличалась упорством, богобоязненностью и самонадеянностью. Она проводила время то в походах, где, сидя на лошади, сама нередко командовала отрядами, то в кабинете, где вместе со своими секретарями занималась чтением и составлением государственных бумаг. Во внешности королевы особо выделялись зеленовато-голубые глаза, характерные для династии Трастамара. Цвет лица был нежным, волосы золотистыми, рост — невысокий, а телосложение не особенно изящным. Тем не менее, отмечали, что в облике её было врожденное благородство и достоинство. Так как детство своё она провела вдали от двора и её не рассматривали, как наследницу, образование её было достаточно слабым. Её обучили чтению, письму и хорошим манерам. Вышивание осталось её любимым занятием и отдыхом от государственных дел. Многие пробелы в своём образовании ей впоследствии пришлось наверстывать самой. 1492 год был эпохальным для правления Изабеллы, в нём совместилось несколько крупнейших событий: покровительство Колумбу и открытие им Америки, а также изгнание евреев и мавров из Испании. Эдикт предписывал всем иудеям Испании в трёхмесячный срок либо креститься, либо покинуть пределы страны; оставшиеся после этого срока объявлялись вне закона. Евреи бежали либо в Португалию (где через 30 лет история повторилась), оттуда — на север Европы, либо в Италию, Османскую империю, страны Северной Африки. Для евреев изгнание стало национальной катастрофой. Формально эдикт касался всех последователей иудаизма, независимо от этнической принадлежности. Смысл указа состоял в лишении иудеев защиты закона, т. е. делал их беззащитными от преступных посягательств и лишал права на законный суд. Разумеется, в таких условиях была невозможна никакая коммерческая и финансовая деятельность, являвшаяся основным занятием испанских евреев. Для возвращения под защиту закона достаточно было принять крещение, но большая часть иудеев предпочла сохранить веру и эмигрировала из Испании.

В последние годы жизни Изабелла превратилась из легендарной героини в меланхоличную затворницу. Она стала медлительной и угрюмой. Из четырёх её дочерей старшая умерла, младшая была далеко в Англии, третья в — Португалии, четвёртой, Иоанне, самой красивой и одухотворённой, вскоре было суждено сойти с ума. Изабелла умерла в 1504 году, оставив наследницей всех своих владений дочь, Иоанну, уже в то время подозреваемую в неуравновешенности. Поэтому в завещании были оговорены специальные условия. Захоронена в Королевской капелле в Гранаде.